STORM简介

Courtesy: This passage is adapted from a course presentation accomplished by Linfeng Zou and Jingyuan Cheng (me).

2013年暑假,我有幸见到了著名的华裔女科学家庄小威,如传说中的一样聪明。庄小威31岁获得美国麦克阿瑟基金会“天才奖”,34岁成为哈佛大学化学与化学生物学系、物理系的双聘正教授,40岁成为美国科学院院士,今年也只有42岁。她发明的STORM荧光成像技术已经转让给尼康公司,基于该技术的荧光显微镜已经上市。本文将对STORM的原理及发展做一个简单介绍。

生物学研究包括技术、问题和体系三部分。STORM是庄小威发明的一种超分辨荧光成像技术,是Stochastic Optical Reconstruction Microscopy(随机光学重构显微镜)的缩写。

首先,什么是超分辨成像
超分辨成像是指突破远场衍射分辨极限的成像技术。远场光学是传统光学理论研究的对象,而远场衍射分辨极限是由德国科学家Abbe在1873年提出的,Abbe认为,由于衍射的限制,一个理想物点经过光学系统成像后,不可能得到理想像点,而是得到一个弥散斑,两个弥散斑靠近后难以区分,因此系统的分辨率被限制。这个分辨率大约为200nm,受可见光的波长及显微镜的数值孔径影响。也就是说,远场显微镜只能分辨出相互间的距离大于这个分辨率的物点。
但是,对于生物学研究而言,这个分辨率是远远不够用的。电子显微镜可以达到更高的分辨率,但是它有不能观察活细胞、只能得到黑白图像等缺点,不能完全取代光学显微镜。目前主要有两种方法来实现超分辨的光学成像:近场成像和单分子成像。STORM是单分子成像方法中的一种。

2003年,Science上发表一篇文章[1],说他们用单分子荧光成像在1.5nm的2D分辨率(以及0.5s的时间分辨率)上观察Myosin V(一种分子马达)在actin上的运动,并提出他们的观察结果支持了Hand-over-hand的运动模型。这突破了远场衍射分辨极限,是借助单分子成像的方法实现的:当视野中只有一个发光点的时候,就不存在两个弥散斑相互重叠的问题。而这个发光点的位置的精确确定是可以通过收集足够多的光子(~1000)实现的:增加测量次数(也就是收集光子数),可以降低衍射、检测器和背景噪音等因素带来的不确定性,减小“弥散斑”的直径。当然,这里就体现了单分子成像通过牺牲时间分辨率(收集多个光子需要时间)来获得空间分辨率的特点。被牺牲掉的时间分辨率在STORM中也没有被挽回。

这篇文章实现了一个目的:单个光点的精确定位。而光学成像还需要实现第二个目的:多个光点的精确定位,其挑战在于:如何区分多个光点的位置。STORM是实现第二个目的的方法之一,在2006年由庄小威提出[2]。它借助的思想很简单:把多个光点问题转化为已经被解决的单个光点问题。由下面一张图就可以说明原理:当多个光点同时发光的时候,由于光点重叠,无法看清;借助一束弱光,将多个光点中的一个激活为荧光态,记录光点位置,注意此时就回到了单个光点的精确定位问题。再借助另一束光,使光点失活为暗态,反复多次(~1000),便可实现多个光点的逐个精确定位。由于被激活的光点是随机的,所以这个技术叫stochastic。

Principle of STORM

Principle of STORM, another illustration

这里还有一个问题,就是如何实现荧光态和暗态的转变。庄小威在2006年用的是Cy3-Cy5对,这一对染料分子就是一个荧光探针,Cy3是activator,Cy5是reporter。这个探针有一个非常好的特点:在657nm红色激光照射下,Cy3-Cy5探针进入暗态;在532nm绿色激光照射下,Cy3-Cy5探针进入荧光态。这就够成了一次循环。并且,对于每个荧光探针,这样的转变可以反复进行上千次。这种性质(photoswitching behavior)使得这样的探针满足超分辨荧光成像方法的需求,至少是单分子荧光成像方法的需求,也是STORM成功的关键所在。目前对于Cyanine Dyes的“暗态”的分子本质,以及荧光态与暗态的转变机制,有研究认为,暗态是Cyanine dye的一个硫酯加成产物[3]。

Photoswitching behavior

2006年STORM发表以后,就获得了很高的关注度。2007年和2008年,庄小威组又发了两篇Science,分别报道了多色和3D的STORM成像[4,5]。

多色STORM的原理非常简单:使用不同的荧光基团,它们具有不同的激发和去活波长。几种新的cyanide dye被研究,包括Alexa 647, Cy5.5和Cy7,加上Cy3和Cy5,它们两两组合,一个作为activator,另一个作为reporter,可以构成多种类似于Cy3-Cy5的荧光探针。这些新的探针具有很好的photoswitching behavior,且在荧光态与暗态的转变中,它们所使用的激光具有不同的波长,包括activation与deactivation波长。由此,便可以得到彩色的STORM图像。

之前提到,最早的超分辨荧光成像是二维的。在2D-STORM的技术基础上,3D-STORM的实现从原理上讲非常简单:在显微系统的光路中加入一个透镜(weak cylindrical lens),利用这个透镜造成的散光效果(astigmatism)。直观上而言,这个透镜的效果是:当物点在预设的焦平面(定义为z=0)之外时,所观察到的像点在x、y方向上有不同程度的形变(即拉长,想象一下你裸眼看到的光点的形状),且用x、y方向的宽度来衡量像点时,两个宽度与z轴位置的函数可以分别用高斯方程来拟合。因此,可以在二维平面的图像上重构出三维的信息。2008年报道,3D-STORM侧向分辨率(lateral)达到20-30nm,轴向分辨率(axial)达到50-60nm。

Principle of 3D-STORM: A weak cylindrical lens was introduced into the imaging path to create two slightly different focal planes for the x and y directions.

2012年,庄小威组发表了新的工作,通过使用两个物镜,把STORM的分辨率提升到侧向<10nm,轴向<20nm[6]。具体原理不在此做介绍。

我关注STORM,并不是仅出于对该技术本身的兴趣。在超分辨光学成像领域,还有许多达到了同一分辨率水平的其他方法。但是,STORM这个技术本身非常聪明,它背后的科学思想简单明了,十分符合一个好的科学工作给人的印象。作为(大约是最)著名的华裔女科学家,庄小威的履历、性格和科学兴趣,大概会给作为学生的我们以一些启发。

Reference

  1. Yildiz A, Forkey J N, McKinney S A, et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization[J]. Science, 2003, 300(5628): 2061-2065.

  2. Rust M J, Bates M, Zhuang X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution[J]. Nature methods, 2006, 3(10): 793.

  3. Dempsey G T, Bates M, Kowtoniuk W E, et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes[J]. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(51): 18192-18193.

  4. Bates M, Huang B, Dempsey G T, et al. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes[J]. Science, 2007, 317(5845): 1749-1753.

  5. Huang B, Wang W, Bates M, et al. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy[J]. Science, 2008, 319(5864): 810-813.

  6. Xu K, Babcock H P, Zhuang X. Dual-objective STORM reveals three-dimensional filament organization in the actin cytoskeleton[J]. Nature methods, 2012.